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  • Transwell肿瘤细胞迁移|细胞培养实验流程
  • 点击次数:1345 发布时间:【2013-11-27】
  • Transwell肿瘤细胞迁移实验流程:

    1基质胶铺板:
    用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

    2制备细胞悬液
    ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
    ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清(或者1�S)培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。

    3接种细胞
    ①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
    ② 24孔板下室一般加入600µl含20�S的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
    ③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

    4结果统计
    直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。

    取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。

    0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。

    400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

    Transwell肿瘤细胞培养实验流程:

    1.取材:
    人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于4℃中,但不宜栽过24小时。
    2.培养基:
    肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640 DMEMMc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
    3.成纤维细胞的排除:
    成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,zui终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤中的关键。

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