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  • 细胞冻存与细胞复苏技术

  • 点击次数：1711 发布时间：【2013-11-27】
  • 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％．15％的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。

    细胞冻存步骤:

    ①     取适量75%酒精棉球擦拭超净工作台面→各种物品按顺序摆放整齐→点燃酒精灯   

    ②     配制冻存液：含10%二甲基亚砜（DMSO）的血清

    ③     处理细胞：取生长对数期的细胞消化成细胞悬液，离心800-1000rpm,5min

    ④     弃上清，加入含10%DMSO冻存液，反复吹打细胞成均匀的细胞悬液

    ⑤     取出冻存管，拧开螺帽

    ⑥     用吸管将上液分别装入冻存管中，拧紧盖子

    ⑦     冻存管上记录细胞名称、冻存日期、培养基的名称

    ⑧     放于冻存盒内，-80℃放置16-18h或隔夜

    ⑨     移入液氮罐中

    ⑩     记录（细胞存放在液氮的位置及液氮罐编号）

    注意事项：1、全程无菌操作观念要强；

                   2、冻存液应提前30min配制，置于4度避光预冷；

    3、若无冻存盒，可采用逐步降温（4℃放置30-60min，-20℃放置30min, -80放置16-18h或隔夜）；

    4、-20℃不可超过1h,以防冰晶过大，造成细胞大量死亡；

    5、冻存盒内异丙醇的量要适中，一般为250ml.

    细胞复苏是指按一定复温速度将细胞悬液恢复到常温的过程。复苏细胞可重新在体外进入增殖状态。
    细胞复苏操作步骤：
    1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
    2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
    3. 离心， 1000rpm，5min；
    4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
    5. 次日更换一次培养液，继续培养。
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