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  • 关于细胞培养中常见的一些技术问题
  • 点击次数:1044 发布时间:【2013-11-28】
  • 简单的总结和收集了一些关于细胞培养中,常出现的些技术问题,希望对大家有帮助:

    1. 液体培养基的保存是冷藏好?还是冷冻好?
      要冷藏!!因为液体培养基经冷冻后再经溶化时,其溶液的pH值会发生改变,溶液往往变碱,某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中,通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月 ~ 一年。

    2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用,及使用方法。
      几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以,各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置-20 ◦C冰冻保存,用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ◦C 冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1ml/支)。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中,其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色,-24◦C保存。

    3.培养用液pH对细胞生长的影响
       由于,大多数细胞适宜pH为7.2~7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受差,无限细胞系耐受力强。
    但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。因此,我们在配制培养用液时,可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时,溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

    4.原代培养和传代培养的概念

    从机体上获取的组织,通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养,在传代前的培养一般称为原代培养。原代培养的zui大优点是:组织细胞刚脱离机体,生物性状尚未发生较大变化,在一定程度上能够反映体内的状态。原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后,由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭,会影响细胞的生长,因此需要进行扩大培养,即传代或称为传代培养,也就是将细胞按12~14的比例传代。但严格说来,不论在进行传代时稀释与否,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。

    传代代数与细胞的世代(增殖代数)并不是同一个概念。在细胞培养时,所说的“第10代细胞”,仅指该细胞已经传代10次;细胞传一代后,一般能倍增3~6次,经过三个阶段,即潜伏期、指数生长期和平台期。当细胞达到平台期时,就需要进行传代培养,否则细胞会中毒,发生形态改变,甚至死亡。

    5.关于传代培养

    在进行传代时,如果是悬浮细胞,只需简单稀释即可,若需完全更换培养液只需低速离心沉淀,再悬浮于合适的培养液中即可。一般细胞每毫升接种数量为5´104~8´105个,传代密度太低,细胞容易死亡,表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。在培养过程中,培养液会由于pH下降而呈现黄色,表明细胞已经达到zui大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞,等长满培养瓶表面,即可进行传代,多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来,以促进传代培养。

    6.细胞系和细胞株

    细胞系和细胞株,两者曾一度混用,导致有些文献中概念不清。下面所指的概念是现在国内外比较通用的,也是绝大多数研究者接受的观点。

    原代培养物经传代成功即称为细胞系(Cell Line),因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系,不能连续培养的称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株(Cell Strain),也就是说,细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

    7。细胞培养环境要求:

    无污染环境:培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身 代谢物质积累等,可导致细胞死亡。因此在进行培养中,保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等,是维持细胞生存的基本条件。

    恒定的温度:维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为 36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与 温度成正比;人体细胞在39-40℃1小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢 复;41-42℃1小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时,细胞全部死亡。

    气体环境:气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的 各种成分。 开放培养时一般把细胞置于 95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

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