当前位置:首页  >  技术文章  >  肿瘤细胞培养技术

肿瘤细胞培养技术

发表时间:2013-11-28  |  点击率:2151

肿瘤细胞培养的相关技术:肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置,首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是zui多的。另外肿瘤对人类是威胁zui大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的
作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性
肿瘤细胞与体内正常细胞相比,不论在体内或在体外,在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体
外培养的肿瘤细胞,其差异较小,但也并非*相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:
(-)形态和性状
培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌
细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
(二)生长增殖
肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生
长的因子,而癌细胞在低血清中(2%~5%)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能
在低血清培养基中生长的现象,已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时,形成集落(克隆)的能
力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时,接触抑制消除,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物。
(三)永生性
永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状,体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽,从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此?也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明,如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的,肿瘤细胞应易于培养。事实上,多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后,也大多增殖若干代后,便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性,顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞证明,永生性和恶性(包括浸润性)是两种性状,受不同基因调控,但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。
(四)浸润性
浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为,培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时,能浸润入其它组织细胞中,并有穿透人工隔膜生长的能力。
(五)异质性
所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多,增殖旺盛,中心区有的细胞衰老退化,有的处于周期阻滞状态,那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞(Stem Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
(六)细胞遗传
大多数肿瘤细胞有遗传学改变,如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成,有干细胞系和数个亚系,并不断进行着适应性演变。
(七)其它
肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于:①依赖性:肿瘤细胞虽有较强克隆生长力,但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存,二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关
系,可能影响癌细胞增殖生长的活性

②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释,达不到肿瘤生长的需求,降低肿瘤细胞的生长增殖力;

③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span,只有干细胞才有强的增殖生长能力,但这些细胞数量很少;

④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。
二、培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面,肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别,初代培养应用组织块和消化培养法均可。(一)要点
1.取材:
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于4℃中,但不宜栽过24小时。
2.培养基:
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常细胞培养不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞*不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
3.成纤维细胞的排除:
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,zui终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法(表2-1)。
表2-1 抑制成纤维细胞生长因素
方法因素组织细胞     选择性附着     选择性附着底物   汇合饲细胞层    选择性培养基
胰蛋白酶    
胶原酶
聚丙烯酰胺
聚四氟乙烯(Teflon)
胶原(猪皮)
小鼠3T3
人胎小肠
D-缬氨酸(Valine)
MCDB-710
MCDB-153
Phenobarbitone
胚胎小肠、心肌、表皮
乳癌
各种肿瘤
转化细胞
表皮细胞
表皮
正常和恶性乳腺上皮
结肠癌
肾组织
乳腺
表皮
肝细胞
注:上表结果为个别实验室经验,仅供参考
(二)成纤维细胞排除法
1.机械刮除法:
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:
(1)标记:镜下观察,用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;
(2)刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记空间;
(3)用Hanks液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;
(4)注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至*除掉为止
2.反复贴壁法:
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,并结合使用不加血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离,操作方法与传代相同。
(1)待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用胰酶消化后,Hanks 冲洗2次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液;
(2)取编号为此A、B、C三个培养瓶;首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5~20分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液,再接种入B培养瓶中后;向A瓶中补充少许*培养液置温箱中继续培养;
(4)培养B瓶中细胞5~20分钟后,接处理A的方法,把培养液注入C培养瓶中;再向B瓶中补加*培养基。
当三个瓶内都含有培养液后,均在温箱中继续培养。如操作成功,次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞,B瓶两类细胞相杂,C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次,直至癌细胞纯化为止。
3.消化排除法:
此法曾用于乳癌细胞的培养,具体程序是:
(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次,然后再换成新的混合液继续消化,并在倒置显微镜下窥视和
不时摇动培养瓶,到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化;
(2)把消化液吸入离心管中,离心去上清,吸入另瓶中,加培养液置温箱中培养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后,
成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理,可能把成纤维细胞除净。
4.胶原酶消化法:
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。
(1)可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;
(2)用Hanks洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。
5.其它方法:
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用;也有人用聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度离心液,加入细胞悬液后,在23℃中800g离心 10分种。在比重1.025~1.050层为成纤维细胞,在比重1.050~1.085层为上皮细胞,再经过分离进行培养。zui近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法,都需进行试验,取得必要经验,找出适合的条件,才能获得好的效果。
(三)提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施
根据人们的经验,肿瘤细胞在体外不易培养,建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后,常出现以下几种情况:*无细胞游出或移动;
有细胞移动和游出,但无细胞增殖,细胞长时间处于停滞状态以致难以传代;
有细胞增殖,传若干代后停止生长或衰退死亡;
传数代后细胞增殖缓慢,经过一段停滞期后,才又呈旺盛生长状态,形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求,并需经过对新环境的适应才能生长,因此欲获得好的培养效果,不能局限于一般培养法,必须采用一些特殊的措施。
1.适宜底物:
把经过纯化的细胞接种在不同的底物上,如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2.生长因子:
应用促细胞生长因子,向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物,常用有胰岛素、雌激素以及其它生长因子。

为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞)的数量,可采用动物体转嫁接种成瘤后,再从动物体内取出进行培养,能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠。
3.动物体媒介培养方法:
(1)瘤块接种:取新鲜瘤组织,用Hanks液洗净血污,切成1~3毫米小块,用穿刺针头吸一小瘤块,用酒精棉球擦拭动物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤块;
(2)饲养观察,待肿瘤生长达较大体积后,剥取出瘤组织;
(3)进行体外培养。
(4)为防止失败,仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种,有活力的肿瘤细胞数量增多,细胞培养易于成功。肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞*相同,但成功率比正常细胞高。
(四)体外培养肿瘤细胞生物学检测
一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后,不论用于实验研究还是建立细胞系,都需要做一系列的细胞生物学测定,主要的目的在于求得证明:
所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞,而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定,根据需要而定,以下为常做的项目和要点。
【形态观察】主要观察细胞的一般形态,如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
【细胞核型分析】检测核型特点,染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
【凝集试验】检测凝集力。
【软琼脂培养】检测集落形成能力。
【异体动物接种】向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液,观察成瘤能力。
【其它】除上述项目外,根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析,荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中,zui主要的为:异体动物(以用裸鼠为上)接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。
当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测,这些项目将在本书第二篇中介绍。
(五)对肿瘤细胞系或细胞株的评价
已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株,无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多,并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验,在使用这些细胞系时,应持特别审慎态度,主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。*,长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变
动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例,都已传代少则几十,多则百代以上后,才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。已如前述,癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去,凡已长期传代的细胞系,都已获得不死性。当前尚未*确证所有癌细胞都具有不死性;因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍*相同(包括不死性)。据上述对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论,避免做概括性的与体内等同的结论,外推与体内等同更是不妥的。广泛来说,应用各种较长时间培养细胞做实验时,都应如此。

TEL:13811479844