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  • 肿瘤细胞培养技术
  • 点击次数:1483 发布时间:【2013-11-28】
  • 肿瘤细胞培养的相关技术:肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置,首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是zui多的。另外肿瘤对人类是威胁zui大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的
    作用。
    一、组织培养肿瘤细胞生物学特性
    肿瘤细胞与体内正常细胞相比,不论在体内或在体外,在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体
    外培养的肿瘤细胞,其差异较小,但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:
    (-)形态和性状
    培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌
    细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
    (二)生长增殖
    肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生
    长的因子,而癌细胞在低血清中(2%~5%)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能
    在低血清培养基中生长的现象,已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时,形成集落(克隆)的能
    力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时,接触抑制消除,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物。
    (三)永生性
    永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状,体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽,从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此?也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明,如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的,肿瘤细胞应易于培养。事实上,多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后,也大多增殖若干代后,便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性,顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞证明,永生性和恶性(包括浸润性)是两种性状,受不同基因调控,但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。
    (四)浸润性
    浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为,培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时,能浸润入其它组织细胞中,并有穿透人工隔膜生长的能力。
    (五)异质性
    所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多,增殖旺盛,中心区有的细胞衰老退化,有的处于周期阻滞状态,那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞(Stem Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
    (六)细胞遗传
    大多数肿瘤细胞有遗传学改变,如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成,有干细胞系和数个亚系,并不断进行着适应性演变。
    (七)其它
    肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于:①依赖性:肿瘤细胞虽有较强克隆生长力,但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存,二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关
    系,可能影响癌细胞增殖生长的活性

    ②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释,达不到肿瘤生长的需求,降低肿瘤细胞的生长增殖力;

    ③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span,只有干细胞才有强的增殖生长能力,但这些细胞数量很少;

    ④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。
    二、培养方法
    肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面,肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别,初代培养应用组织块和消化培养法均可。(一)要点
    1.取材:
    人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于4℃中,但不宜栽过24小时。
    2.培养基:
    肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常细胞培养不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
    3.成纤维细胞的排除:
    成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,zui终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法(表2-1)。
    表2-1 抑制成纤维细胞生长因素
    方法因素组织细胞     选择性附着     选择性附着底物   汇合饲细胞层    选择性培养基
    胰蛋白酶    
    胶原酶
    聚丙烯酰胺
    聚四氟乙烯(Teflon)
    胶原(猪皮)
    小鼠3T3
    人胎小肠
    D-缬氨酸(Valine)
    MCDB-710
    MCDB-153
    Phenobarbitone
    胚胎小肠、心肌、表皮
    乳癌
    各种肿瘤
    转化细胞
    表皮细胞
    表皮
    正常和恶性乳腺上皮
    结肠癌
    肾组织
    乳腺
    表皮
    肝细胞
    注:上表结果为个别实验室经验,仅供参考
    (二)成纤维细胞排除法
    1.机械刮除法:
    是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:
    (1)标记:镜下观察,用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;
    (2)刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记空间;
    (3)用Hanks液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;
    (4)注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至完全除掉为止
    2.反复贴壁法:
    根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,并结合使用不加血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离,操作方法与传代相同。
    (1)待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用胰酶消化后,Hanks 冲洗2次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液;
    (2)取编号为此A、B、C三个培养瓶;首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5~20分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液,再接种入B培养瓶中后;向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养;
    (4)培养B瓶中细胞5~20分钟后,接处理A的方法,把培养液注入C培养瓶中;再向B瓶中补加完全培养基。
    当三个瓶内都含有培养液后,均在温箱中继续培养。如操作成功,次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞,B瓶两类细胞相杂,C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次,直至癌细胞纯化为止。
    3.消化排除法:
    此法曾用于乳癌细胞的培养,具体程序是:
    (1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次,然后再换成新的混合液继续消化,并在倒置显微镜下窥视和
    不时摇动培养瓶,到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化;
    (2)把消化液吸入离心管中,离心去上清,吸入另瓶中,加培养液置温箱中培养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后,
    成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理,可能把成纤维细胞除净。
    4.胶原酶消化法:
    本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。
    (1)可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;
    (2)用Hanks洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。
    5.其它方法:
    有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用;也有人用聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度离心液,加入细胞悬液后,在23℃中800g离心 10分种。在比重1.025~1.050层为成纤维细胞,在比重1.050~1.085层为上皮细胞,再经过分离进行培养。zui近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
    选用上述任何一种方法,都需进行试验,取得必要经验,找出适合的条件,才能获得好的效果。
    (三)提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施
    根据人们的经验,肿瘤细胞在体外不易培养,建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后,常出现以下几种情况:完全无细胞游出或移动;
    有细胞移动和游出,但无细胞增殖,细胞长时间处于停滞状态以致难以传代;
    有细胞增殖,传若干代后停止生长或衰退死亡;
    传数代后细胞增殖缓慢,经过一段停滞期后,才又呈旺盛生长状态,形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
    以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求,并需经过对新环境的适应才能生长,因此欲获得好的培养效果,不能局限于一般培养法,必须采用一些特殊的措施。
    1.适宜底物:
    把经过纯化的细胞接种在不同的底物上,如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
    2.生长因子:
    应用促细胞生长因子,向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物,常用有胰岛素、雌激素以及其它生长因子。

    为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞)的数量,可采用动物体转嫁接种成瘤后,再从动物体内取出进行培养,能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠。
    3.动物体媒介培养方法:
    (1)瘤块接种:取新鲜瘤组织,用Hanks液洗净血污,切成1~3毫米小块,用穿刺针头吸一小瘤块,用酒精棉球擦拭动物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤块;
    (2)饲养观察,待肿瘤生长达较大体积后,剥取出瘤组织;
    (3)进行体外培养。
    (4)为防止失败,仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种,有活力的肿瘤细胞数量增多,细胞培养易于成功。肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同,但成功率比正常细胞高。
    (四)体外培养肿瘤细胞生物学检测
    一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后,不论用于实验研究还是建立细胞系,都需要做一系列的细胞生物学测定,主要的目的在于求得证明:
    所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞,而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定,根据需要而定,以下为常做的项目和要点。
    【形态观察】主要观察细胞的一般形态,如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
    【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
    【细胞核型分析】检测核型特点,染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
    【凝集试验】检测凝集力。
    【软琼脂培养】检测集落形成能力。
    【异体动物接种】向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液,观察成瘤能力。
    【其它】除上述项目外,根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析,荧光显微镜观察等。
    在上述肿瘤细胞生物学检测中,zui主要的为:异体动物(以用裸鼠为上)接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。
    当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测,这些项目将在本书第二篇中介绍。
    (五)对肿瘤细胞系或细胞株的评价
    已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株,无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多,并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验,在使用这些细胞系时,应持特别审慎态度,主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知,长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变
    动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例,都已传代少则几十,多则百代以上后,才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。已如前述,癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去,凡已长期传代的细胞系,都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性;因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同(包括不死性)。据上述对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论,避免做概括性的与体内等同的结论,外推与体内等同更是不妥的。广泛来说,应用各种较长时间培养细胞做实验时,都应如此。

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