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  • 脂质体转染法-细胞转染技术详解
  • 点击次数:2904 发布时间:【2013-11-28】
  • 脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层,又称为人工生物膜。具有膜的融合及内吞作用,可用作外源物质进入细胞的载体。相对于电穿孔法和磷酸钙共沉淀转染法,脂质体介导转染法简便易行,成本适中,具有较高的转染率和较小的细胞毒性阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用将 DNA分子包裹人内,形成DNA一脂复合体,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔也通过直接渗透作用,将DNA传递进入细胞,形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。

    操作步骤:

    1、取对数生长的细胞,接种于培养板,加培养液,培养过ye(细胞长至85-90%满);

    按说明书进行转染实验:

    2、在缓冲液中加入质粒DNA轻轻振荡混匀10s

    3、在缓冲液中加入适量脂质体,轻轻振荡混匀10s

    4、将脂质体混合液慢慢滴加到质粒混合液管中(有的转染试剂规定顺序,有的不规定),振荡混匀10s,室温温育一定时间(20min);

    5、给培养板换液。

    6、将转染混合液加入每孔中,于培养箱内孵育一定时间;

    7、弃去转染混合液,更换正常培养液,按实验需要分别进行不同的处理。

    为了达到高的转染效率,在转染实验过程中,需要注意以下几点:

    1.纯化siRNA

    在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。

    2.避免RNA酶污染

    微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

    3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

    通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

    4.避免使用抗生素

    Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到zui佳转染效果。

    5.选择合适的转染试剂

    针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。

    6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

    对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

    7.通过标记siRNA来优化实验

    荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

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