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  • Transwell侵袭实验总结

  • 点击次数:1367 发布时间:【2013-11-28】
  • 个人的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验,其他方面的Transwell应用我不太清楚,因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。
    1.实验用品:

    ① Transwell小室:
    多种厂家可提供,论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
    这些厂家提供的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很方便,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是非常贵,24孔板配套的小室,每个价格约130元,不推荐给大家。BD也有已包被好的,价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室,是论坛里比较常用的,好像是要自己铺胶,但据说每个小室成本只有40左右,应该比较适合中国国情。
    下面是一些战友提供的价格,具体建议大家代理商咨询。linanping1979战友提供的价格:coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格:Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。梅林战友提供的BD价格: 240RMB一块(6.5um,24孔,12instert),好像是没胶的。liguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是:corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。平均每个20元不到。
    Transwell小室按照公司的要求,都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很干净,用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法:用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10min×2。
    因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列,膜很结实,擦不坏,可以反复用很多次,但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能重复用一次,真黑啊!很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的,大家可以试试。
    本人没见过,有兴趣的可以自己研究一下。
    另外,根据论坛战友提供的信息,osmonic公司有的膜出售,鼎国生物代理。Transwell小室用过后,可把原来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,这样又可以用了,不过我没用过,有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法: trasnwell小室做一次后,将原来的膜去掉,重新泡酸,泡酒精,使用前照紫外,然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上,剪掉多余的边缘。再照紫外。
    ② 上层培养液:
    上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2% BSA。
    ③ 细胞:
    值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不必要的浪费,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,并不是笔小数目,还是小心为妙。
    另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验。
    ④ 基质胶:
    常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的:Matrigel是BD公司生产的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格:BD公司的matrigel 1500左右。
    如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了。
    ⑤ 下层培养液:
    下层常用含5%-10% FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子,但个人认为,FBS仍是zui合适的。
    ⑥ 细胞培养板:
    常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔zui常用。细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
    ⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。很多战友认为这不是必须的,而且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为,如果培养时间很长(>24h),细胞还是会掉到下室里面去,所以有条件的话,还是在膜下层涂上FN。
    另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。

     

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