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  • real-time PCR 常用仪器和探针
  • 点击次数:1088 发布时间:【2013-12-08】
  • 1.SYBR Green I
    一种DNA结合染料,能非特异性地与双链DNA结合,结合后发出荧光,价格便宜,但因无特异性,易受到非特异性扩增和引物二聚体地的影响,是定量结果不可靠。可用融解曲线分析区分特异性和非特异性扩增,引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光有很大帮助。
    2.Taqman探针
    也称为水解寡核苷酸探针。该探针在5’端标记报告荧光基团,在3’端标记淬灭荧光基团,在探针完整时报告荧光基团发出的荧光被淬灭荧光基团吸收,因此没有荧光产生。在延伸阶段,由于DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性,5’端标记报告荧光基团被水解掉,远离淬灭荧光基团,于是产生荧光信号。Taqman探针的优点是可以利用多种荧光同时进行多重分析,这是SYBR等DNA结合荧光基团所不具备的优点。
    3.分子信标(molecular beacons):
    为一发夹结构,环区与目的片段特异性互补,茎区的5’端和3’端分别标有荧光基团和淬灭基团。自由状态的分子信标呈发夹结构,荧光基团和淬灭基团紧密接触,能量以热的形式消除,不产生荧光。退火时,发夹结果打开,环区与目的片段特异性互补结合,荧光基团和淬灭基团分开,释放出荧光。分子信标优于Taqman探针之处是可以检测单个核苷酸的突变,适合于SNP分析和等位基因突变分析。缺点是设计比较困难,既要避免产生强的背景信号,又要避免茎部杂交过强,影响其与模板的退火,从而影响荧光的生成。
    4.杂交探针
    是一种新型的荧光探针,由两条探针组成,一条在5’端标记荧光(3’端被封闭,以防止退火后的延伸),一条在3’端标记荧光,其中一个为受体荧光基团,另一个为供体荧光基团,供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱,自由状态时只能检测到供体荧光基团发出的荧光。退火时两条探针与目的基因特异性结合,形成首尾连接,两个荧光基团互相靠近,供体基团发出的能量激发受体基团发出荧光,检测时只检测受体基团发出的荧光。只有当两条探针均与目的基因特异性结合时,才能检测到受体基团发出的荧光,因此检测的特异性大大增加。
    5.Scorpion引物/探针
    由一条发夹结构的探针和一条引物构成,探针的5’端和3’端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3’端通过一个非扩增的单体(防止探针退火后的延伸)与引物的5’端相连。在自由状态,报告荧光和淬灭荧光很接近,不产生荧光。变性阶段茎环结构打开,退火时引物与模板结合并延伸,环区与新合成的目的基因的互补区域结合,此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上,是分子内的结合。由于发夹结构打开,报告荧光和淬灭荧光分离,因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。由于Scorpion引物/探针中序列特异性引物和探针在同一分子上,因此信号的产生特别快。

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