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  • RT-PCR 实验原理与步骤

  • 点击次数:1293 发布时间:【2013-12-08】
  • 实验材料
    水稻叶片的 RNA 。

    实验原理:目前 PCR 技术只能扩增 DNA 模板,对 RNA 模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增,这种在 mRNA 反转录后进行的 PCR 扩增称为 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏,对 RNA 的质量要求较低,操作简便,它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。本实验以水稻叶片 RNA 为材料,检测β -actin 基因的表达。实验中设定2 个阴性对照:一个不加模板 RNA ,另一个不加反转录酶,主要是消除 DNA 及PCR 试剂方面引起的假阳性;同时以叶片 DNA 为阳性对照,检验 PCR 试剂和扩增过程是否有问题。

    实验步骤
    RNA 抽提
    1. 用TRIzol 试剂提取植物总RNA。
    2. 将总RNA 稀释到终浓度1μg/μl 。
    3.在0.5 ml 的无菌eppendorf 管中分别加入:
    Total RNA 0.5- 1 μ g
    RNase-free DNase I 1 μ l ( 1 u / μ l)
    10 × DNase I buffer 1 μ l
    DEPC 处理的ddH2O 5 μ l
    4. 37 ℃ 保温15 min, 然后70 ℃ 保温10 min. 。
    反转录反应
    1. 加1μl 500 μ g / ml oligo (dT)15 primer, 涡旋混合,简单离心。
    2.在65 ℃加热混合物10 分钟, 然后室温10 分钟,再分别加入下列试剂:
    5 × *链缓冲液4μl
    0.1 M DTT 2μl
    10 m M dNTP 1μl
    3.涡旋混合后,简单离心,37℃水浴2 min.。
    4. 加2μl 200 U / ml 的M-MLV 反转录酶。轻缓混合,37℃保温1h。其总体积应为20μl。
    5. 70 ℃加热15 min 终止反应,然后加20μl 的ddH2O ,cDNA *链可作为模板用于PCR 扩增。
    6. 若要去除与cDNA 互补的RNA,可加1μl (2 units)的RNase H,然后37 ℃保温20 min。
    PCR 扩增
    1. 在冰上混合加入下列试剂:
    cDNA *链 1μl
    TaKaRa Ex Taq (5u/1μl) 0.5μl
    10 × Ex Taq buffer 5μl
    dNTP mixture (2mM) 4μl
    Primer F (10 mM) 2μl
    Primer R (10 mM) 2μl
    ddH2O 35.5μl
    2. PCR 反应程序
    Step 1 94℃ 3min 1
    Step 2 94℃ 1min, 60℃ 1min, 72℃ 1min, 30-40 Cycles
    Step 3 72℃ 5 min 1
    Step 4 4℃ forever
    3. 以β-actin 作为每个RT-PCR 的内在标准,以水代替反转录酶来检测RT-PCR
    中的DNA 污染。
    所使用试剂
    5 × *链缓冲液 (GIBCO Part No.Y00146)
    100 mM DTT (GIBCO Part No.Y11147)
    200 U/μl M-MLV Reverse transcriptase (GIBCO Part No.28025-021)
    500μg/ml oligo (dT) 15 primer (Promega Cat. No. C110A 9362612)
    10 mM dNTP 混合物
    RNase-free DNase I (TaKaRa Code No. 2215 CA)
    5U/μl Ex Taq polymerase 和10 × buffer (TaKaRa Code No. RR001D CA)
    10μM specific Primer F and R
    Sterile ddH2O

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