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  • MTT实验问题汇总
  • 点击次数:1041 发布时间:【2013-12-08】
  • 实验前应明确的问题

    1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。

    2. 药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

    3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,zui后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的zui明显)。

    4. 培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。

    5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

    6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

    7. 实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。

    8. 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

    实验步骤

    贴壁细胞:

    1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。

    2. 5%CO2,37℃ 孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况

    3. 5%CO2,37℃ 孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

    4. 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

    5. 终止培养,小心吸去孔内培养液。

    6. 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

    7. 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)

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