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  • 脂质体2000转染DNA的操作过程
  • 点击次数:676 发布时间:【2015-01-13】
  •    脂质体2000适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下zui方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。

      用脂质体2000进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者zui佳的剂量,确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜。

      细胞种类:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

      快速脂质体转染法操作步骤如下:

      (1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时,使其达到50~60%板底面积。

      (2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下:

      ①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

      ②旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。

      ③室温下放置5~10分钟,使DNA结合在脂质体上。

      (3)弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37℃培养3~5小时。

      (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM,继续培养14~24小时,

      (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培养24~48小时。

      (6)用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

      稳定的脂质体转染方法如下:

      (1)接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染。

      (2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

      (3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培养48小时。

      (4)吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。

      注:脂质体,即lipofectin regeant,LR

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