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  • 你知道无内毒素质粒小提中量试剂盒的操作方法么?

  • 点击次数:39 发布时间:【2022-04-18】
  •   你知道无内毒素质粒小提中量试剂盒的操作方法么?不知道没关系,下面让我们一起来了解一下吧。
     
      1、取50µL新鲜的菌液接种到15-50mL(勿超过50mL)的LB培养基,37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000xg离心10分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。
     
      2、加入2.5mLBufferA1(确保已加入RNaseA),用移液器或涡流震荡确保**沉淀重新悬浮。
     
      3、加入2.5mLBufferB1,轻轻地反转5-10次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
     
      4、加入600µLBufferN3,立即反转5次,用手用力摇晃3-5次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。
     
      5、将离心管转至高速离心机,在室温下13,000xg离心10分钟(若上清中有白色沉淀,可再次离心)。
     
      6、定量吸取离心后的上清液至新的15mL管中(避免吸起沉淀),加入0.1倍体积的EndoCleanBuffer,混匀后冰浴10分钟,其间不时摇匀(若EndoCleanBuffer粘稠难吸,可将枪头剪掉头后再吸取)。
     
      7、室温下(冰浴取出后务必使溶液温度恢复到23oC以上,否则溶液不分层)13,000xg离心10分钟(也可在2,500xg离心15分钟)。此时溶液分为两层,上层水相含有质粒,下层红色有机相含有。
     
      8、将上层水相转移至一个新的15mL管中,加入3mL的BufferN3及3mL的100%ethonal,用手用力甩5次以混匀,该混合溶液需要需马上进行过柱吸附操作。
     
      9、立即转移6.0mL裂解液至带收集管的DNA柱中,室温下>2,500xg离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。
     
      10、可选:向DNA柱中加入3.0mLBufferKB,室温下>2,500xg离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。
     
      11、向离心柱中加入5mL70%乙醇,室温下>2,500xg离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“11”。
     
      12、将离心柱放回高速离心机中,室温下>2,500xg开盖离心10分钟,以彻底去除残留的乙醇。
     
      13、将离心柱转至一个新的15mL离心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5mL的EndofreeElutionBuffer,室温放置1分钟,>2,500xg离心5分钟,以洗脱质粒DNA。若想提高得率,可用洗脱得到的0.5mL的EndofreeElutionBuffer再洗脱一次,收集到新的离心管中。
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