配置RPMI-1640培养基的注意事项如下：
1)配制培养基最好使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。
2)培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。
3)溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。
4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3(2.0g)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。
5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U/瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U/瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。
6) 调pH值：加水到900ml(在需要加10%小牛血清的情况下)，然后用5% NaHCO3调节pH到7.2。
7) 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面(光面)朝上。过滤后分装于小瓶中(100或200ml)。
8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存(-20℃)。临用前将加入小牛血清(10%~20%)。
9)每次配液时，需要的其他辅助性液体(Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等)也可以同时配制，分别过滤。
10)市售小牛血清使用前都应该灭活(56℃，30min)，以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml。选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。
11)由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调pH值。但此种方法过滤较困难，只适于正压过滤。
12)每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分(主要为谷氨酰胺)损失，造成实验繁琐或者污染。
13)最后，制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用(滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌)。
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