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Western Blotting实验技术应用试剂大全

发表时间:2013-12-03  |  点击率:3656

一、 Western blot概述

Western Blot 法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过 PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如 NC膜, PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

A.     蛋白抽提 -蛋白样品的制备

蛋白抽提试剂

起始材料

产品名称

货号

规格

价格 (RMB)

品牌

大肠杆菌

BugBuster protein extraction reagent

70584-3

100ml

1059

Merck

BugBusterMaster Mix extraction reagent

71456-3

100ml

2377

Merck

酵母细胞,真菌,植物

YeastBuster protein extraction reagent

71186-3

100ml

1194

Merck

昆虫 /哺乳动物细胞

CytoBuster protein extraction reagent

71009-3

50ml

915

Merck

哺乳动物细胞

RIPA buffer solution

89900

100ml

923

Pierce

哺乳动物组织

T-PER 动物组织蛋白抽提试剂

78510

500ml

3405

Pierce

细胞不同部位蛋白提取试剂盒

起始材料

产品名称

货号

规格

价格 (RMB)

品牌

哺乳动物细胞 /组织

ProteoExtract 全蛋白质组抽提试剂盒

539779

Kit

5165

Merck

哺乳动物细胞 /组织

ProteoExtract 亚细胞蛋白质组抽提试剂盒

539790

20T

6081

Merck

哺乳动物细胞 /组织

ProteoExtract 跨膜蛋白抽提试剂盒

71772-3

20T

6014

Merck

哺乳动物细胞 /组织

ProteoExtract 天然跨膜蛋白抽提试剂盒

444810

KIT

5481

Merck

哺乳动物细胞

NE-PER 核蛋白 -胞浆蛋白抽提试剂盒

78833

Kit

2586

Pierce

 

B. 蛋白酶 /磷酸酶抑制剂

  对细胞进行裂解后,与目标蛋白一起释放出来的还有蛋白酶和磷酸酶,它们会水解蛋白为多肽或氨基酸。此过程会导致许多重要蛋白的流失,进而严重的影响下有实验。因此需要在细胞的裂解过程中加入相应蛋白酶或磷酸酶抑制剂,从而保证目标蛋白的完整性。

单一成分蛋白酶抑制剂

抑制剂

货号

规格

价格RMB

品牌

靶蛋白酶家族

可溶解

PMSF

1g

300

Mpbio

丝氨酸蛋白酶(可逆型)

甲醇

AEBSF

J582

50mg

798

Amresco

无毒的 PMSF替代物,丝氨酸蛋白酶(不可逆)

亮抑蛋白肽(leupeptin

5mg

871

Mpbio

丝氨酸 ,半胱氨酸蛋白酶(可逆型)

抑肽酶 (Aprotinin)

5mg

268

Mpbio

丝氨酸蛋白酶(可逆型)

胃抑肽酶 A(Pepstain A)

5mg

531

Mpbio

天冬氨酸蛋白酶(可逆型)

甲醇

抑氨肽酶(Bestatin

J579

10mg

1784

Amresco

氨基酸多肽酶(可逆型)

甲醇

E-64

J586

5mg

1348

Amresco

可逆型半胱氨酸(不可逆)

EDTA  2Na

500g

1138

Mpbio

金属蛋白酶(可逆型)

单一蛋白酶抑制剂的作用谱始终是受限制,多数情况下未必能*保证目的蛋白活性不受影响,尤其需要检测同一样品内的多个蛋白时。“Cocktail -蛋白酶 /磷酸酶混合物此时就是*的选择了。

蛋白酶抑制剂混合片剂( EASY packs

抑制剂

货号

规格

价格RMB

品牌

特点

cOmplete  mini

5892970001

30  10ml

2470

Roche

 

同时持续抑制丝氨酸蛋白酶 ,半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等在内的多种蛋白酶;可应用几乎所有的组织及细胞提取物,包括动物,植物,酵母,细菌和真菌样品;整个操作过程只需要将片剂*溶解到裂解液中;

Complete,mini,EDTA-Free

5892791001

30  10ml

2470

cOmplete

4693116001

20  50ml

3339

cOmplete  EDTA-Free

4693132001

20  50ml

3339

磷酸酶抑制剂混合片剂( EASY packs

抑制剂

货号

规格

价格RMB

品牌

特点

PhosSTOP

14906845001

10 片(10ml

1292

Roche

同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸(脂)酶,及丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸(脂)酶和酪酸蛋白磷酸(脂)酶在内的多种酶;与 cOmplete蛋白酶抑制剂兼容。

PhosSTOP

14906837001

20 片(10ml

2432

C. 蛋白样品的定量

目前常用比色法来确定样品蛋白的含量。将化学试剂加入到蛋白样品溶液中发生颜色变化,利用分光光度计或酶标仪检测这一变化,并与已知浓度的蛋白标准曲线做比较从而确定样品的浓度。WISSEN公司提供 Pierce公司的蛋白定量产品, pierce BCA蛋白定量试剂盒是zui的产品之一,深受研究人员的依赖。

常用蛋白定量试剂盒

产品名称

货号

规格

价格 (RMB)

检测波长

重要兼容物

重要不兼容物

蛋白间的均一性

BCA 蛋白定量试剂盒

23227

250T

1254

562nm

去污剂

还原剂,螯合剂

改良 Lowry法蛋白定量试剂盒

23240

480T

1338

750nm

SDS

大部分去污剂,还原剂,螯合剂

考马斯蛋白定量试剂盒

23200

630T

1175

595nm

还原剂和螯合剂

去污剂

660 纳米蛋白定量试剂盒

22662

300T

2136

660nm

去污剂,还原剂

离子型去污剂

蛋白标准品及单一试剂

产品名称

货号

规格

价格 (RMB)

检测波长

白蛋白标准品

23209

10*1ml

611

常用蛋白标准品,高纯度,易获得

牛血清γ -球蛋白标准品

23212

10*1ml

765

测定抗体浓度时常用的标准品

BCA 蛋白定量试剂 A

23228

500ml

991

成分:碱性碳酸盐缓冲液中含 BCA和酒石酸盐

BCA 蛋白定量试剂 B

23224

25ml

488

成分: 4%无水硫酸铜溶液

福林酚试剂

F9252

100ml

365

Lowry 法总蛋白定量用试剂( 2N

          

D. 蛋白样品浓缩于纯化

为了节省样本,提高下有实验的成功率,需要对蛋白样品进行浓缩,从而提高蛋白样品的有效检测浓度。在此本公司提供由 Millipore(密理博)的超滤浓缩管(离心过滤),以简单的离心方法将您的蛋白样品浓缩。客户可根据截留的分子量,膜类型,样本体积来选择该产品

超滤浓缩管

产品名称

膜类型

起始体积

浓缩体积

回收率

规格

截留分子量

货号

0.5ml 超滤管

Ultracel (超滤)

0.5ml

15-20ul

 90%

24  /

3kDa

UFC500324

10kDa

UFC501024

4ml 超滤管

Ultracel (超滤)

4ml

50ul

 90%

24  /

3kDa

UFC800324

10kDa

UFC801024

15ml 超滤管

Ultracel (超滤)

15ml

200ul

 90%

24  /

3kDa

UFC900324

10kDa

UFC901024

E. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE

SDS-PAGE 的基本原理是在蛋白质样品中加入 SDS和含强还原剂巯基乙醇或 DTT的样品处理液。 SDS作为强阴离子表面活性剂,破坏蛋白质分子的二级和三级结构;强还原剂断开二硫键破坏蛋白质的四级结构,是蛋白质分离解聚成单链分子。解聚后的侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物,此时蛋白质的电泳迁移率则与所带电荷的性质无关,主要取决于蛋白质的相对分子质量。因此 SDS-PAGE电泳可将不同分子量大小的蛋白质分离开,从而便于对目的蛋白进行研究。

SDS-PAGE 电泳结束后常常通过染色和脱色评定结果的优劣,一般选择考马斯亮蓝 R-250进行染胶,染色灵敏度高。另外也常常对转膜后的凝胶上残余蛋白进行染色,来分析转膜效果的好坏。

聚丙烯酰胺凝胶的配置

产品名称

货号

规格

价格 RMB

品牌

丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺 Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v)

SD6012

500ml

176

Sangon

丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺 Acryl/Bis solution (29: 1), 40% (w/v)

SD6017

500ml

176

Sangon

丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺 Acryl/Bis solution (37.5: 1), 40% (w/v)

SD6014

500ml

176

Sangon

十二烷基硫酸钠( SDS

L5750

500g

280

Sigma 分装

 TEMED ; N,N,N  ,N -四甲基乙二胺

T2250

100ml

196

Sigma 分装

(过硫酸铵) Ammonium persulfate

0486

100g

120

Amresco 分装

Western Blotting 缓冲体系的配置

产品名称

货号

规格

价格 RMB

品牌

Tris

0234

100g

105

Amresco 分装

甘氨酸( Glycine

Japan

500g

80

Japan

β -巯基乙醇 - 违禁品

0482

100ml

120

Amresco 分装

Bromophenol blue 溴酚蓝

0449

10g

112

Amresco 分装

Glycerol 甘油

G7893

250ml

95

Sigma 分装

DTT 二硫苏糖醇

233155

10g

330

Merck 分装

考马斯亮蓝 R-250

04821616

25g

389

Mpbio

Ponceau S 丽春红 S

10g

273

Mpbio

Lane Marker Reducing Sample Buffer

39000

5 mL

699

Pierce

Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer

39001

5ml

699

Pierce

F 蛋白 Marker

蛋白分子量标准( Marker)不仅具有指示蛋白条带对应的分子量大小,还可以检测蛋白转移师傅成功或者蛋白样品在凝胶上的电泳程度等作用。选择合适的 Marker不仅方便准确的定性目的蛋白,还能够很好的监测整个实验体系,一遍分析可能遇到的问题, Fermentas公司提供了各种范围的未染色 /预染色的蛋白 Marker以及修饰标记蛋白 Marker

蛋白 Marker选择

产品名称

旧货号

货号

规格

价格 RMB

PageRuler Unstained Protein Ladder 10-200kDa

SM0661

26614

2*250ul

300

PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder 5-250 kDa

SM1881

26630

2*250ul

500

PageRuler Prestained Protein Ladder, 10-170kDa

SM0671

26616

2*250ul

870

PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 -250kDa

SM1811

26619

2*250ul

1100

G 转膜与封闭

电泳结束后需要将分离后的蛋白质从凝胶体系中转移到固相载体(如 PVDF膜, NC膜)上,并在膜上进行一抗,二抗的孵育与洗涤,zui后进行显色。使用考马斯亮蓝 R-250对转膜后的凝胶上残余蛋白的检测,可以监测转膜效果的好坏。

产品名称

货号

规格 /

*RMB

膜的选择

0.2um NC 

10401396

30cm*3.00M

2200

7-20KD 蛋白

0.22um PVDF 

ISEQ00010

30cm*3.00M

2200

适用蛋白测序和低分子量蛋白印迹

0.45um PVDF 

IPVH00010

26.5cm*3.75m

1690

适用多种印迹实验

封闭( Blocking)是 western blot 以及其他免疫实验中*的步骤之一,封闭的好坏直接影响背景高低,从而决定是否能跑出一张美观的 WB图。 WB封闭的目的是结合印迹膜上的非特异性位点,常用的如脱脂奶粉, BSA,吐温 -20.

产品名称

货号

规格

价格RMB

品牌

脱脂奶粉

D8340

500G

385

BD

BSA( 无蛋白酶 

25g

385

Mpbio

BSA (标准级)

25g

300

Mpbio

吐温 -20

0210316890

500ml

238

Mpbio

H显色

化学显色检测

产品名称

货号

规格

价格 RMB

品牌

DAB( 二氨联苯胺 

1g

211

Mpbio

TMB  3,3',5,5'-四甲基联苯胺)

1g

858

Mpbio

BCIP( 对甲苯胺蓝 

25mg

420

Mpbio

NBT( 氯化硝基四氮唑蓝 

250mg

932

Mpbio

NBT/BCIP 染色试剂

08980871

100ml

699

Mpbio

DAB 显色试剂盒 黄色

AR1021

KIT

240

Boster

DAB 显色试剂盒 蓝色

AR1024

KIT

240

Boster

AEC 显色试剂盒 红色

AR1020

KIT

140

Boster

NBT/BCIP 染色试剂盒

AR1023

KIT

280

Boster

化学发光检测试剂

ECL 化学发光底物

32109

50ml

633

Pierce

32106

500ml

2174

Pierce

SuperSignal West Pico 化学发光底物(皮克级)

34080

500ml

2837

Pierce

SuperSignal West Dura 持久性化学发光底物

34075

100ml

3285

Pierce

超敏化学发光底物

34095

100ml

4263

Pierce

X 光片

5*7in

100 

160

柯达

I 抗体剥离与膜再生

  当同一个样本中含有两个或两个以上的蛋白需要检测,当对某一个蛋白的检测结果不理想需要调整实验条件货重新分析做验证实验,有了抗体剥离试剂,讲印迹膜上的抗体洗脱,让你在同一张膜上做多次杂交实验,让你免去重复做电泳和转膜的繁琐不走,大大节省你的试验时间和成本。

化学显色检测

产品名称

货号

规格

价格 RMB

品牌

Restore TMWestern Blot stripping buffer

21062

30ml

332

Thermo

21059

500ml

1127

Thermo

J 内参抗体

内参即内部参照,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各种组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用做参照物。

内参的作用: 1检测整个 WB流程是否正常,包括转膜,显色及发光体系等; 2检测基因表达产物是否正确及表达产微量的相对变化; 3校正上样误差,确保蛋白定量结果的可信度;

常用的内参抗体

货号

名称

适应种属

应用范围

规格

价格 RMB

1854-1

β -actin 42kDa

HU,Ms  Rt

WB,IHC,ICC

100ul

2500

50ul

1400

2251-1

GAPDH  36kDa

HU,Ms  Rt

WB,IHC,ICC  IP

100ul

2500

50ul

1400

12009-1

β -Tubulin 50kDa

HU,Ms  Rt

WB,IHC,ICC,FC,IP

100ul

2500

50ul

1400

H 标签抗体

沃比森公司提供的标签抗体涵盖 6-Histidine Flag-tag HA tag c-Myc GST.GFP等常用标签,种类齐全,特异性高,是进行融合蛋白研究*的辅助工具之一。

TEL:13811479844