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  • Western Blotting实验技术应用试剂大全
  • 点击次数:2927 发布时间:【2013-12-03】
  • 一、 Western blot概述

    Western Blot 法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过 PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如 NC膜, PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

    A.     蛋白抽提 -蛋白样品的制备

    蛋白抽提试剂

    起始材料

    产品名称

    货号

    规格

    价格 (RMB)

    品牌

    大肠杆菌

    BugBuster protein extraction reagent

    70584-3

    100ml

    1059

    Merck

    BugBusterMaster Mix extraction reagent

    71456-3

    100ml

    2377

    Merck

    酵母细胞,真菌,植物

    YeastBuster protein extraction reagent

    71186-3

    100ml

    1194

    Merck

    昆虫 /哺乳动物细胞

    CytoBuster protein extraction reagent

    71009-3

    50ml

    915

    Merck

    哺乳动物细胞

    RIPA buffer solution

    89900

    100ml

    923

    Pierce

    哺乳动物组织

    T-PER 动物组织蛋白抽提试剂

    78510

    500ml

    3405

    Pierce

    细胞不同部位蛋白提取试剂盒

    起始材料

    产品名称

    货号

    规格

    价格 (RMB)

    品牌

    哺乳动物细胞 /组织

    ProteoExtract 全蛋白质组抽提试剂盒

    539779

    Kit

    5165

    Merck

    哺乳动物细胞 /组织

    ProteoExtract 亚细胞蛋白质组抽提试剂盒

    539790

    20T

    6081

    Merck

    哺乳动物细胞 /组织

    ProteoExtract 跨膜蛋白抽提试剂盒

    71772-3

    20T

    6014

    Merck

    哺乳动物细胞 /组织

    ProteoExtract 天然跨膜蛋白抽提试剂盒

    444810

    KIT

    5481

    Merck

    哺乳动物细胞

    NE-PER 核蛋白 -胞浆蛋白抽提试剂盒

    78833

    Kit

    2586

    Pierce

     

    B. 蛋白酶 /磷酸酶抑制剂

      对细胞进行裂解后,与目标蛋白一起释放出来的还有蛋白酶和磷酸酶,它们会水解蛋白为多肽或氨基酸。此过程会导致许多重要蛋白的流失,进而严重的影响下有实验。因此需要在细胞的裂解过程中加入相应蛋白酶或磷酸酶抑制剂,从而保证目标蛋白的完整性。

    单一成分蛋白酶抑制剂

    抑制剂

    货号

    规格

    价格RMB

    品牌

    靶蛋白酶家族

    可溶解

    PMSF

    1g

    300

    Mpbio

    丝氨酸蛋白酶(可逆型)

    甲醇

    AEBSF

    J582

    50mg

    798

    Amresco

    无毒的 PMSF替代物,丝氨酸蛋白酶(不可逆)

    亮抑蛋白肽(leupeptin

    5mg

    871

    Mpbio

    丝氨酸 ,半胱氨酸蛋白酶(可逆型)

    抑肽酶 (Aprotinin)

    5mg

    268

    Mpbio

    丝氨酸蛋白酶(可逆型)

    胃抑肽酶 A(Pepstain A)

    5mg

    531

    Mpbio

    天冬氨酸蛋白酶(可逆型)

    甲醇

    抑氨肽酶(Bestatin

    J579

    10mg

    1784

    Amresco

    氨基酸多肽酶(可逆型)

    甲醇

    E-64

    J586

    5mg

    1348

    Amresco

    可逆型半胱氨酸(不可逆)

    EDTA  2Na

    500g

    1138

    Mpbio

    金属蛋白酶(可逆型)

    单一蛋白酶抑制剂的作用谱始终是受限制,多数情况下未必能完全保证目的蛋白活性不受影响,尤其需要检测同一样品内的多个蛋白时。“Cocktail -蛋白酶 /磷酸酶混合物此时就是zui佳的选择了。

    蛋白酶抑制剂混合片剂( EASY packs

    抑制剂

    货号

    规格

    价格RMB

    品牌

    特点

    cOmplete  mini

    5892970001

    30  10ml

    2470

    Roche

     

    同时持续抑制丝氨酸蛋白酶 ,半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等在内的多种蛋白酶;可应用几乎所有的组织及细胞提取物,包括动物,植物,酵母,细菌和真菌样品;整个操作过程只需要将片剂完全溶解到裂解液中;

    Complete,mini,EDTA-Free

    5892791001

    30  10ml

    2470

    cOmplete

    4693116001

    20  50ml

    3339

    cOmplete  EDTA-Free

    4693132001

    20  50ml

    3339

    磷酸酶抑制剂混合片剂( EASY packs

    抑制剂

    货号

    规格

    价格RMB

    品牌

    特点

    PhosSTOP

    14906845001

    10 片(10ml

    1292

    Roche

    同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸(脂)酶,及丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸(脂)酶和酪酸蛋白磷酸(脂)酶在内的多种酶;与 cOmplete蛋白酶抑制剂兼容。

    PhosSTOP

    14906837001

    20 片(10ml

    2432

    C. 蛋白样品的定量

    目前常用比色法来确定样品蛋白的含量。将化学试剂加入到蛋白样品溶液中发生颜色变化,利用分光光度计或酶标仪检测这一变化,并与已知浓度的蛋白标准曲线做比较从而确定样品的浓度。WISSEN公司提供 Pierce公司的蛋白定量产品, pierce BCA蛋白定量试剂盒是全球zui的产品之一,深受研究人员的依赖。

    常用蛋白定量试剂盒

    产品名称

    货号

    规格

    价格 (RMB)

    检测波长

    重要兼容物

    重要不兼容物

    蛋白间的均一性

    BCA 蛋白定量试剂盒

    23227

    250T

    1254

    562nm

    去污剂

    还原剂,螯合剂

    改良 Lowry法蛋白定量试剂盒

    23240

    480T

    1338

    750nm

    SDS

    大部分去污剂,还原剂,螯合剂

    考马斯蛋白定量试剂盒

    23200

    630T

    1175

    595nm

    还原剂和螯合剂

    去污剂

    660 纳米蛋白定量试剂盒

    22662

    300T

    2136

    660nm

    去污剂,还原剂

    离子型去污剂

    蛋白标准品及单一试剂

    产品名称

    货号

    规格

    价格 (RMB)

    检测波长

    白蛋白标准品

    23209

    10*1ml

    611

    常用蛋白标准品,高纯度,易获得

    牛血清γ -球蛋白标准品

    23212

    10*1ml

    765

    测定抗体浓度时常用的标准品

    BCA 蛋白定量试剂 A

    23228

    500ml

    991

    成分:碱性碳酸盐缓冲液中含 BCA和酒石酸盐

    BCA 蛋白定量试剂 B

    23224

    25ml

    488

    成分: 4%无水硫酸铜溶液

    福林酚试剂

    F9252

    100ml

    365

    Lowry 法总蛋白定量用试剂( 2N

              

    D. 蛋白样品浓缩于纯化

    为了节省样本,提高下有实验的成功率,需要对蛋白样品进行浓缩,从而提高蛋白样品的有效检测浓度。在此本公司提供由 Millipore(密理博)的超滤浓缩管(离心过滤),以简单的离心方法将您的蛋白样品浓缩。客户可根据截留的分子量,膜类型,样本体积来选择该产品

    超滤浓缩管

    产品名称

    膜类型

    起始体积

    浓缩体积

    回收率

    规格

    截留分子量

    货号

    0.5ml 超滤管

    Ultracel (超滤)

    0.5ml

    15-20ul

     90%

    24  /

    3kDa

    UFC500324

    10kDa

    UFC501024

    4ml 超滤管

    Ultracel (超滤)

    4ml

    50ul

     90%

    24  /

    3kDa

    UFC800324

    10kDa

    UFC801024

    15ml 超滤管

    Ultracel (超滤)

    15ml

    200ul

     90%

    24  /

    3kDa

    UFC900324

    10kDa

    UFC901024

    E. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE

    SDS-PAGE 的基本原理是在蛋白质样品中加入 SDS和含强还原剂巯基乙醇或 DTT的样品处理液。 SDS作为强阴离子表面活性剂,破坏蛋白质分子的二级和三级结构;强还原剂断开二硫键破坏蛋白质的四级结构,是蛋白质分离解聚成单链分子。解聚后的侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物,此时蛋白质的电泳迁移率则与所带电荷的性质无关,主要取决于蛋白质的相对分子质量。因此 SDS-PAGE电泳可将不同分子量大小的蛋白质分离开,从而便于对目的蛋白进行研究。

    SDS-PAGE 电泳结束后常常通过染色和脱色评定结果的优劣,一般选择考马斯亮蓝 R-250进行染胶,染色灵敏度高。另外也常常对转膜后的凝胶上残余蛋白进行染色,来分析转膜效果的好坏。

    聚丙烯酰胺凝胶的配置

    产品名称

    货号

    规格

    价格 RMB

    品牌

    丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺 Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v)

    SD6012

    500ml

    176

    Sangon

    丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺 Acryl/Bis solution (29: 1), 40% (w/v)

    SD6017

    500ml

    176

    Sangon

    丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺 Acryl/Bis solution (37.5: 1), 40% (w/v)

    SD6014

    500ml

    176

    Sangon

    十二烷基硫酸钠( SDS

    L5750

    500g

    280

    Sigma 分装

     TEMED ; N,N,N  ,N -四甲基乙二胺

    T2250

    100ml

    196

    Sigma 分装

    (过硫酸铵) Ammonium persulfate

    0486

    100g

    120

    Amresco 分装

    Western Blotting 缓冲体系的配置

    产品名称

    货号

    规格

    价格 RMB

    品牌

    Tris

    0234

    100g

    105

    Amresco 分装

    甘氨酸( Glycine

    Japan

    500g

    80

    Japan

    β -巯基乙醇 - 违禁品

    0482

    100ml

    120

    Amresco 分装

    Bromophenol blue 溴酚蓝

    0449

    10g

    112

    Amresco 分装

    Glycerol 甘油

    G7893

    250ml

    95

    Sigma 分装

    DTT 二硫苏糖醇

    233155

    10g

    330

    Merck 分装

    考马斯亮蓝 R-250

    04821616

    25g

    389

    Mpbio

    Ponceau S 丽春红 S

    10g

    273

    Mpbio

    Lane Marker Reducing Sample Buffer

    39000

    5 mL

    699

    Pierce

    Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer

    39001

    5ml

    699

    Pierce

    F 蛋白 Marker

    蛋白分子量标准( Marker)不仅具有指示蛋白条带对应的分子量大小,还可以检测蛋白转移师傅成功或者蛋白样品在凝胶上的电泳程度等作用。选择合适的 Marker不仅方便准确的定性目的蛋白,还能够很好的监测整个实验体系,一遍分析可能遇到的问题, Fermentas公司提供了各种范围的未染色 /预染色的蛋白 Marker以及修饰标记蛋白 Marker

    蛋白 Marker选择

    产品名称

    旧货号

    货号

    规格

    价格 RMB

    PageRuler Unstained Protein Ladder 10-200kDa

    SM0661

    26614

    2*250ul

    300

    PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder 5-250 kDa

    SM1881

    26630

    2*250ul

    500

    PageRuler Prestained Protein Ladder, 10-170kDa

    SM0671

    26616

    2*250ul

    870

    PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 -250kDa

    SM1811

    26619

    2*250ul

    1100

    G 转膜与封闭

    电泳结束后需要将分离后的蛋白质从凝胶体系中转移到固相载体(如 PVDF膜, NC膜)上,并在膜上进行一抗,二抗的孵育与洗涤,zui后进行显色。使用考马斯亮蓝 R-250对转膜后的凝胶上残余蛋白的检测,可以监测转膜效果的好坏。

    产品名称

    货号

    规格 /

    促销价RMB

    膜的选择

    0.2um NC 

    10401396

    30cm*3.00M

    2200

    7-20KD 蛋白

    0.22um PVDF 

    ISEQ00010

    30cm*3.00M

    2200

    适用蛋白测序和低分子量蛋白印迹

    0.45um PVDF 

    IPVH00010

    26.5cm*3.75m

    1690

    适用多种印迹实验

    封闭( Blocking)是 western blot 以及其他免疫实验中不可或缺的步骤之一,封闭的好坏直接影响背景高低,从而决定是否能跑出一张美观的 WB图。 WB封闭的目的是结合印迹膜上的非特异性位点,常用的如脱脂奶粉, BSA,吐温 -20.

    产品名称

    货号

    规格

    价格RMB

    品牌

    脱脂奶粉

    D8340

    500G

    385

    BD

    BSA( 无蛋白酶 

    25g

    385

    Mpbio

    BSA (标准级)

    25g

    300

    Mpbio

    吐温 -20

    0210316890

    500ml

    238

    Mpbio

    H显色

    化学显色检测

    产品名称

    货号

    规格

    价格 RMB

    品牌

    DAB( 二氨联苯胺 

    1g

    211

    Mpbio

    TMB  3,3',5,5'-四甲基联苯胺)

    1g

    858

    Mpbio

    BCIP( 对甲苯胺蓝 

    25mg

    420

    Mpbio

    NBT( 氯化硝基四氮唑蓝 

    250mg

    932

    Mpbio

    NBT/BCIP 染色试剂

    08980871

    100ml

    699

    Mpbio

    DAB 显色试剂盒 黄色

    AR1021

    KIT

    240

    Boster

    DAB 显色试剂盒 蓝色

    AR1024

    KIT

    240

    Boster

    AEC 显色试剂盒 红色

    AR1020

    KIT

    140

    Boster

    NBT/BCIP 染色试剂盒

    AR1023

    KIT

    280

    Boster

    化学发光检测试剂

    ECL 化学发光底物

    32109

    50ml

    633

    Pierce

    32106

    500ml

    2174

    Pierce

    SuperSignal West Pico 化学发光底物(皮克级)

    34080

    500ml

    2837

    Pierce

    SuperSignal West Dura 持久性化学发光底物

    34075

    100ml

    3285

    Pierce

    超敏化学发光底物

    34095

    100ml

    4263

    Pierce

    X 光片

    5*7in

    100 

    160

    柯达

    I 抗体剥离与膜再生

      当同一个样本中含有两个或两个以上的蛋白需要检测,当对某一个蛋白的检测结果不理想需要调整实验条件货重新分析做验证实验,有了抗体剥离试剂,讲印迹膜上的抗体洗脱,让你在同一张膜上做多次杂交实验,让你免去重复做电泳和转膜的繁琐不走,大大节省你的试验时间和成本。

    化学显色检测

    产品名称

    货号

    规格

    价格 RMB

    品牌

    Restore TMWestern Blot stripping buffer

    21062

    30ml

    332

    Thermo

    21059

    500ml

    1127

    Thermo

    J 内参抗体

    内参即内部参照,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各种组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用做参照物。

    内参的作用: 1检测整个 WB流程是否正常,包括转膜,显色及发光体系等; 2检测基因表达产物是否正确及表达产微量的相对变化; 3校正上样误差,确保蛋白定量结果的可信度;

    常用的内参抗体

    货号

    名称

    适应种属

    应用范围

    规格

    价格 RMB

    1854-1

    β -actin 42kDa

    HU,Ms  Rt

    WB,IHC,ICC

    100ul

    2500

    50ul

    1400

    2251-1

    GAPDH  36kDa

    HU,Ms  Rt

    WB,IHC,ICC  IP

    100ul

    2500

    50ul

    1400

    12009-1

    β -Tubulin 50kDa

    HU,Ms  Rt

    WB,IHC,ICC,FC,IP

    100ul

    2500

    50ul

    1400

    H 标签抗体

    沃比森公司提供的标签抗体涵盖 6-Histidine Flag-tag HA tag c-Myc GST.GFP等常用标签,种类齐全,特异性高,是进行融合蛋白研究不可或缺的辅助工具之一。

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    联系人:吕梦寒

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