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  • 葡聚糖凝胶柱的预处理、装柱、加样、洗脱收集与回收
  • 点击次数:1371 发布时间:【2014-12-15】
  •  1、葡聚糖凝胶柱的预处理
     
       称取Sephadex葡聚糖凝胶(50-100目)约5g,加入蒸馏水100ml,置室温下3h进行溶胀。
     
    2、葡聚糖凝胶柱的装柱
     
       凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好,先加入1/3柱体积蒸馏水,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入,使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹。否则,必须到出重装,装好后,用蒸馏水平衡2-3h即可加样品分离。
     
    3、葡聚糖凝胶柱的加样
     
    加样前,首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出,直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)为止。然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要让溶液把凝胶冲松浮起,加完样品后,打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐,再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2-3次,待全部进入层析柱后,即可进行洗脱。
     
    4、葡聚糖凝胶柱的洗脱与收集
     
    洗脱时,用蒸馏水作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8-1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集,每管收集3ml,共收集10管。据经验,4或5号管核苷酸浓度zui大,可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异,管号会有变化,必要时可用紫外检测A260nm,找出浓度zui大的管号。
     
    5、凝胶的再生和回收
     
       葡聚糖凝胶柱使用一次后,必须反冲疏松一次,平衡后再使用。若使用数次,就需要再生处理。用0.1mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡,然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕,将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干,再用95%乙醇洗两次,在60℃烘箱中烘干,回收保存。
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