琼脂糖凝胶电泳实验之凝胶制作与点样

 

1、琼脂糖凝胶浓度

 

   配制凝胶的浓度据实验需要而变 ，一般在0．8％ ～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g／ml；也可在电泳结束后染色。

 

2、梳板的选用

 

   一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。

 

二、点样

 

    点样需加上样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品沉入孑L底；指示样品的迁移过程，上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6× (10×)，表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孑L，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip)进入点样孑L即可将样品注入孑L内，千万不可将Tip尖插至孑L底，并点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。