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  • 琼脂糖凝胶电泳实验之凝胶制作与点样
  • 点击次数:822 发布时间:【2014-12-10】
  •  一、琼脂糖凝胶制作
     
    1、琼脂糖凝胶浓度
     
       配制凝胶的浓度据实验需要而变 ,一般在0.8% ~2.0%之间,如果一次配制凝胶100 ml,没用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加,水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定,补水办法:一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶后补充相应的水分至原刻度;二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中,终浓度为0.5 t*g/ml;也可在电泳结束后染色。
     
    2、梳板的选用
     
       一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板,梳齿宽厚,形成的点样孑L容积较大,用于DNA 片段回收实验等;相反,梳齿窄而薄,形成的点样孑L容积就较小,用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定,一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果分析。另外,每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孑L底层,导致点样后样品渗漏。当然,点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孑L。
     
    二、点样
     
        点样需加上样缓冲液,因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度,使样品沉入孑L底;指示样品的迁移过程,上样缓冲液中一般加了两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂,DNA染色剂是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6× (10×),表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孑L,用另一只手帮助固定移液器下端,移液器枪头(Tip)进入点样孑L即可将样品注入孑L内,千万不可将Tip尖插至孑L底,并点上适合的DNA分子量标准,所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。
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