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琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理及方法

更新时间:2016-03-14  |  点击率:1930
   琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98%~99%),近似自由电泳,样品扩散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

  琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可以进行电泳。琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。制成干膜可长期保存。

  琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸,如DNA鉴定,DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便,设备简单,需样品量少,分辨能力高,已成为基因工程研究中常用实验方法之一。本文主要给大家说说,琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理及方法。

  一、琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理

  琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,但不带电荷,是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正极移动,不同DNA分子片段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。

  二、琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的方法

  琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。

  (1)核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

  ① DNA分子的大小在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。

  ② 琼脂脂糖的浓度。不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

  (2)核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

  不同构型DNA的移动速度次序为:供价闭环DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

  三、琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的实验步骤

  1、安装电泳槽

  将有机玻璃的电泳凝胶床洗净,晾干,用胶带将两端的开口封好,放在水平的工作台上,插上样品梳。

  2、琼脂糖凝胶的制备

  称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)置微波炉或沸水浴中加热至*溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。

  3、灌胶

  将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

  4、待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。

  5、加样

  将DNA样品与加样缓冲液按4:1混匀后,用微量移液器将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μl,记录样品的点样次序和加样量。

  6、电泳

  安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至3-5V/cm,电泳1-3hr,当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。

  7、染色和观察

  取出凝胶,放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min,即可在254nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂,操作时要小心,必须戴手套。

  四、实验器具及药品

  电泳仪,电泳槽,紫外透射反射仪,恒温水浴锅,微波炉,微量进样器,三羟甲基氨基甲烷,盐酸,醋酸钠,EDTA,琼脂糖,溴酚蓝,溴化乙锭。