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  • 了解一下活性氧检测试剂盒的操作过程吧

  • 点击次数:21 发布时间:【2021-04-02】
  •   活性氧检测试剂盒是一种基于荧光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的荧光强度变化,定量检测细胞内活性氧水平的常用方法。
     
      下面让我们来了解一下活性氧检测试剂盒的操作过程吧
     
      一、装载探针
     
      1、原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
     
      1)细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
     
      注:必须保证细胞状态健康,且检测时不会过度生长。
     
      2) 药物诱导:去除细胞培养液,加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。
     
      阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM,加入细胞,一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。(如,HeLa细胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h;)
     
      3)探针准备:探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
     
      4) 探针装载:吸除诱导用药物,加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。例如;对于6孔板通常不少于1000 μL,对于96孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。
     
      5) 细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
     
      2、收集细胞后装载探针:适用于贴壁细胞和悬浮细胞。
     
      1) 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。
     
      2)药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM,加入细胞,一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如,HeLa细胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h;】
     
      3) 探针准备:探针装载前,按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
     
      4) 探针装载:去除细胞内药物,离心收集细胞,加入适当稀释好的探针,使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。
     
      注:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整。如,对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106。每隔3-5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
     
      5)细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
     
      二、检测
     
      原位装载探针法:激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
     
      收集细胞后装载探针:用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
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