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想知道如何使用罗氏潮霉素B?看看这些吧

发表时间:2021-03-02  |  点击率:548
  罗氏潮霉素B(Hygromycin B)是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,大肠杆菌( Escherichia coli.)来源的潮霉素抗性基因(hyg或hph),编码潮霉素B磷酸转移酶,将潮霉素B转化成不具有生物活性的磷酸化产物,从而起到解毒作用。
 
  下面让我们一起来了解一下罗氏潮霉素B的的使用步骤吧
 
  案例一:杀灭曲线确定佳杀死浓度(仅作参考)
 
  往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞,细胞密度约50-200细胞/孔;细胞贴壁之后,往每孔加入含不同浓度(如50-1000μg/mL,至少5个浓度)潮霉素B的200μL新鲜培养基;
 
  37℃,5% CO2培养箱孵育细胞10-14天;
 
  培养5-7天后更换新的培养液,培养液内含有相应浓度的潮霉素B;
 
  10-14天后使用细胞增殖方法如MTT,CCK-8等评估细胞活力;也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的小浓度为筛选浓度。
 
  2.案例二:筛选稳定转染细胞
 
  对于贴壁细胞,直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基,然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml;对于悬浮细胞,无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基,然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基;
 
  5-7天后,如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基;
 
  再孵育细胞5-7天;
 
  10-14天孵育后,培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一,更换不含潮霉素B的新鲜培养基。

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