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看完本篇你就知道在使用超滤管时的注意事项了

发表时间:2021-12-13  |  点击率:459
  超滤管通常用于蛋白质浓缩和缓冲液置换。还有其他型号,它们具有不同的体积大小和超滤管,这取决于目标蛋白质的分子量,浓缩前的体积和浓缩的目标体积,可重用的。
 
  下面让我们一起来了解一下超滤管的使用方法吧。
 
  1、选择合适的超滤管,主要考虑MWCO和浓度体积。通常,分子量应不大于靶蛋白分子量的1/3。如果目标蛋白的分子量约为10kD,则可以使用截留分子量为3kD的超滤管。
 
  2、新购买的超滤是干燥的。使用前添加MilliQ水。水量*通过膜,并在冰浴或冰箱中预冷几分钟。然后倒出水以添加蛋白质溶液。蛋白质溶液的量不得超过试管顶部的白线。操作轻巧。在添加蛋白质溶液之前,需要将超滤管插入冰中进行预冷却。
 
  3、平衡。质量和重心都必须平衡。注意,速度和加速度不能太快,否则会直接损坏超滤膜。开始离心超滤(将离心机预冷至4度)。膜片和旋转轴的方向可根据说明进行调整(在角离心机的情况下,膜片垂直于轴)。在实际使用中,一般速度低于说明书中的规定,可能会延长离心管的使用寿命。
 
  4、浓缩至剩余的1ml时,[取50ul的家用Bradford溶液,加入10ul的流过液,看它是否变成蓝色,并确定超滤管是否泄漏了蛋白质。
 
  如果管泄漏,则倒入上层,然后流回新管中以开始超滤。要准确确定试管是否泄漏,请以5mg/mlBSA离心10min,然后将其通过,运行蛋白凝胶或Bradford][粗测量],继续添加剩余的蛋白质溶液以浓缩(在冰上操作以防止蛋白质加热),直到所有浓缩溶液都加入为止。
 
  在离心过程中,要注意是否发生蛋白质沉淀并引起试管阻塞。如果发生沉淀,请确定沉淀的具体原因,蛋白质浓度是否过高或缓冲液是否不合适;前者可以通过同时使用多个超滤管来解决,以降低浓度,后者可以改变不同的缓冲液,直到蛋白质沉淀为止。
 
  5、前面的步骤用于浓缩蛋白质。如果要更换缓冲液,则在将总蛋白溶液浓缩至约1ml时,轻轻地添加新的缓冲液(通过0。22um超滤膜进行超滤),然后连续浓缩至约1ml,持续三倍,以最终浓度取决于所需的蛋白质浓度,通常不大于500ul,也可以浓缩至小于200ul。根据每次至少10次的体积浓度,是三次的1000倍以上,基本上可以达到更换缓冲液的目的。
 
  6、取出最终的蛋白质浓缩物。在冰上操作。使用黄色的移液器吸头(200ul),沿边缘轻轻插入移液器吸头,然后轻轻吹动并混合蛋白质溶液。
 
  注意不要触摸超滤膜。每次吸取浓缩溶液至200ul,直到吸完为止。不必抽出试管底部的最后浓缩溶液,否则太难了,可能会损坏超滤膜。最后,在不通过超滤膜的情况下,将MilliQ水添加到超滤管中,以防止滤膜失水和干燥。

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